本发明涉及具有通式(I)的丙型肝炎病毒抑制剂。本发明还涉及含有所述化合物的组合物和使用所述化合物抑制HCV的方法。
1.式(I)化合物或其可药用盐，所述式(I)化合物为：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中n和m各自独立为0；R¹选自氢和烷基，其中所述烷基任选取代有一个、两个、三个或四个卤素基团；R²和R³各自独立选自烷氧基、烷基、氰基、二烷基氨基、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基和羟基；R⁴选自氢和烷基，其中所述烷基任选取代有一个卤素；R⁵选自烷氧基羰基和卤代烷氧基羰基；和Q为C₆-C₉不饱和碳链；其中所述烷基是指由含有一个至十个碳原子的直链或支链饱和烃衍生的基团。
2.权利要求1的化合物或其可药用盐，其中R⁴为烷基。
3.权利要求2的化合物或其可药用盐，其中R⁵为烷氧基羰基。
4.权利要求1的化合物或其可药用盐，其中R¹为取代有两个卤素基团的烷基。
5.权利要求1的化合物或其可药用盐，其中n和m各自为0；R¹为取代有两个卤素基团的烷基；R⁴为烷基；R⁵为烷氧基羰基；和Q为C₇-C₈不饱和链。
6.一种化合物或其可药用盐，所述化合物选自：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>
7.一种组合物，其包含权利要求1的化合物或其可药用盐和可药用载体。
8.权利要求7的组合物，其还包含至少一种具有抗HCV活性的其它化合物。
9.权利要求8的组合物，其中所述其它化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。
10.权利要求9的组合物，其中所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、同感干扰素、干扰素α2A和成淋巴细胞样干扰素τ。
11.权利要求8的组合物，其中所述其它化合物中的至少一种选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、可提高1型辅助T细胞应答发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。
12.权利要求8的组合物，其中所述其它化合物中的至少一种可有效抑制靶标的功能以治疗HCV感染，所述靶标选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCVxa0NS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCVxa0NS5A蛋白和IMPDH。
13.权利要求1的化合物或其可药用盐在制备用于在患者中治疗HCV感染的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其还包括在给药权利要求1的化合物或其可药用盐之前、之后或同时给药至少一种具有抗HCV活性的其它化合物。
15.权利要求14的用途，其中所述其它化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。
16.权利要求15的用途，其中所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、同感干扰素、干扰素α2A和成淋巴细胞样干扰素τ。
17.权利要求14的用途，其中所述其它化合物中的至少一种选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、可提高1型辅助T细胞应答发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。
18.权利要求14的用途，其中所述其它化合物中的至少一种可有效抑制靶标的功能以治疗HCV感染，所述靶标选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCVxa0NS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCVxa0NS5A蛋白和IMPDH。对相关申请的交叉参考本申请要求2008年12月15日提交的美国临时申请61/122,487的权益。技术领域
本发明大体上涉及抗病毒化合物且更具体地涉及对由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS3蛋白酶(在本申请中也称为“丝氨酸蛋白酶”)的功能进行抑制的化合物、包含所述化合物的组合物和对NS3蛋白酶的功能进行抑制的方法。
背景技术
HCV是主要的人类病原体，其在世界范围内感染估计一亿七千万人，这大致是1型人类免疫缺陷病毒感染数量的5倍。这些HCV感染个体中相当大的部分发展成严重的进行性肝脏疾病，包括肝硬化和肝细胞癌。目前，最有效的HCV疗法使用α-干扰素和利巴韦林的组合，其在40％的患者中产生持续的效果。最新的临床结果证实，作为单一疗法，PEG化的α-干扰素优于未修饰的α-干扰素。然而，即使就涉及PEG化α-干扰素和利巴韦林组合的实验性治疗方案而言，相当多的患者也没有出现病毒载量的持续减少。因此，就开发用于治疗HCV感染的有效疗法而言，存在明显和迫切的需要。HCV是正链RNA病毒。基于对所推断的氨基酸序列进行的比较和5’-非翻译区的广泛相似性，已将HCV归类为黄病毒科中独立的属。黄病毒科的所有成员都具有包封的病毒体，其含有的正链RNA基因组通过翻译单一的连续的可读框而编码所有已知的病毒专属性蛋白质。在整个HCV基因组的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列中发现了相当程度的异质性。已表征了6种主要的基因型且已描述了多于50种的亚型。HCV的主要基因型在世界范围内的分布是不同的且HCV遗传异质性的临床重要性仍然是难以确定的，尽管对基因型对发病和治疗的可能影响进行了大量的研究。单链HCVxa0RNA基因组的长度为约9500个核苷酸且具有单一的可读框(ORF)，其编码由约3000个氨基酸组成的单一的大的多蛋白。在被感染的细胞中，这种多蛋白在多个位点被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶所裂解以产生结构蛋白和非结构(NS)蛋白。就HCV而言，成熟的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的产生受到两种病毒蛋白酶的影响。第一种病毒蛋白酶在NS2-NS3接合处进行裂解；第二种病毒蛋白酶为包含在NS3的N-末端区域内的丝氨酸蛋白酶且介导NS3下游的所有随后裂解，既在NS3-NS4A裂解位点以顺式进行裂解，又在其余的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A和NS5A-NS5B位点以反式进行裂解。NS4A蛋白似乎具有多种功能，其充当NS3蛋白酶的辅因子且可能有助于NS3及其它病毒复制酶组分的膜定位。NS3蛋白与NS4A形成复合物，这是进行高效的多蛋白加工由此在所有位点促进蛋白水解性裂解所必需的。NS3蛋白还显示出三磷酸核苷酶和RNA解旋酶活性。NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶，其参与HCV的复制。
发明内容
本发明提供肽化合物，其可抑制NS3蛋白酶(例如与NS4A蛋白酶组合的NS3蛋白酶)的功能。另外，本发明描述了向患者给药联合疗法，其中可有效抑制HCVxa0NS3蛋白酶的本发明化合物可与具有抗HCV活性的其它化合物一起给药。本发明第一个方面提供式(I)化合物或其可药用盐：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中n和m各自独立为0、1、2或3；R¹选自氢、烯基、烷基和环烷基，其中所述烯基、烷基和环烷基各自任选取代有一个、两个、三个或四个卤素基团；R²和R³各自独立选自烷氧基、烷基、氰基、二烷基氨基、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基和羟基；R⁴选自氢、烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基，其中所述烷基和环烷基各自任选取代有选自烷氧基、卤代烷氧基、卤素、卤代烷基、氰基和二烷基氨基的一个基团；R⁵选自氢、烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、卤代烷氧基羰基、卤代烷基、卤代烷基羰基、(NR^aR^b)羰基和(NR^aR^b)磺酰基，其中R^a和R^b独立选自氢、烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、杂环基和杂环基烷基；和Q为C₆-C₉饱和或不饱和碳链。本发明第一个方面的第一个实施方案提供式(I)化合物或其可药用盐，其中R⁴为烷基。本发明第一个方面的第二个实施方案提供式(I)化合物或其可药用盐，其中R⁵为烷氧基羰基。本发明第一个方面的第三个实施方案提供式(I)化合物或其可药用盐，其中n和m各自为0。本发明第一个方面的第四个实施方案提供式(I)化合物或其可药用盐，其中R³为烷氧基。本发明第一个方面的第五个实施方案提供式(I)化合物或其可药用盐，其中R¹为取代有两个卤素基团的烷基。本发明第一个方面的第六个实施方案提供式(I)化合物或其可药用盐，其中n和m各自为0；R¹为取代有两个卤素基团的烷基；R⁴为烷基；R⁵为烷氧基羰基；和Q为C₇-C₈不饱和链。本发明第二个方面提供组合物，其包含式(I)化合物或其可药用盐和可药用载体。在本发明第二个方面的第一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种具有抗HCV活性的其它化合物。在第二个方面的第二个实施方案中，所述其它化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。在第二个方面的第三个实施方案中，所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、同感干扰素、干扰素α2A和成淋巴细胞样干扰素τ。本发明第二个方面的第四个实施方案提供组合物，其包含式(I)化合物或其可药用盐、可药用载体和至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其中所述其它化合物中的至少一种选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、可提高1型辅助T细胞应答发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特(Imiqimod)、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。本发明第二个方面的第五个实施方案提供组合物，其包含式(I)化合物或其可药用盐、可药用载体和至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其中所述其它化合物中的至少一种可有效抑制靶标的功能以治疗HCV感染，所述靶标选自HCV金属蛋白酶(HCVxa0metalloprotease)、HCV丝氨酸蛋白酶(HCVxa0serinexa0protease)、HCV聚合酶(HCVxa0polymerase)、HCV解螺旋酶(HCVxa0helicase)、HCVxa0NS4B蛋白(HCVxa0NS4Bxa0protein)、HCV进入(HCVxa0entry)、HCV组装(HCVassembly)、HCV释出(HCVxa0egress)、HCVxa0NS5A蛋白(HCVxa0NS5Axa0protein)和IMPDH。本发明第三个方面提供组合物，其包含式(I)化合物或其可药用盐、一种、两种、三种、四种或五种具有抗HCV活性的其它化合物和可药用载体。在第三个方面的第一个实施方案中，所述组合物包含三种或四种具有抗HCV活性的其它化合物。在第三个方面的第二个实施方案中，所述组合物包含一种或两种具有抗HCV活性的其它化合物。本发明第四个方面提供在患者中治疗HCV感染的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐。在第四个方面的第一个实施方案中，所述方法还包括在式(I)化合物或其可药用盐之前、之后或同时给药至少一种具有抗HCV活性的其它化合物。在第四个方面的第二个实施方案中，所述其它化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。在第四个方面的第三个实施方案中，所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、同感干扰素、干扰素α2A和成淋巴细胞样干扰素τ。本发明第四个方面的第四个实施方案提供在患者中治疗HCV感染的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的式(I)或其可药用盐且在式(I)化合物或其可药用盐之前、之后或同时给药至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其中所述其它化合物中的至少一种选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、可提高1型辅助T细胞应答发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。本发明第四个方面的第五个实施方面提供在患者中治疗HCV感染的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的式(I)或其可药用盐且在式(I)化合物或其可药用盐之前、之后或同时给药至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其中所述其它化合物中的至少一种可有效抑制靶标的功能以治疗HCV感染，所述靶标选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCVxa0NS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCVNS5A蛋白和IMPDH。本发明第五个方面提供在患者中治疗HCV感染的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐且在式(I)化合物或其可药用盐之前、之后或同时给药一种、两种、三种、四种或五种具有抗HCV活性的其它化合物。在第五个方面的第一个实施方案中，所述方法包括给药三种或四种具有抗HCV活性的其它化合物。在第五个方面的第二个实施方案中，所述方法包括给药一种或两种具有抗HCV活性的其它化合物。本发明其它方面可包括本申请所述实施方案的合适组合。其它方面和实施方案可参见本申请提供的描述。本申请提供的描述应该被理解为与化学键合的规则和原理相符。在一些情况下，可能需要除去氢原子以在任何给定位置提供取代基。应该理解的是，本发明涵盖的化合物是就用作药物物质而言合适稳定的那些化合物。应该理解的是，位于分子中具体位置的任何取代基或变量的定义独立于其在该分子中其它位置的定义。例如，当n为2时，两个R²基团彼此可相同或不同。将本申请说明书引用的所有专利、专利申请和参考文献全文引入本申请作为参考。在不一致的情况下将以本发明(包括定义)为准。本申请使用的单数形式“不定冠词(a)”、“不定冠词(an)”和“定冠词(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。本申请使用的术语“烯基”是指具有两个至十个碳原子且含有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团。本申请使用的术语“烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的烷基。本申请使用的术语“烷氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的烷氧基。本申请使用的术语“烷基”是指由含有一个至十个碳原子的直链或支链饱和烃衍生的基团。本申请使用的术语“烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的烷基。本申请使用的术语“烷基磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分连接的烷基。本申请使用的术语“芳基”是指苯基或二环稠合环系，在所述二环稠合环系中一个环是苯环或两个环都是苯环。二环稠合环系包含与四至六元芳族或非芳族碳环稠合的苯环。本发明芳基可通过该基团中任何可取代的碳原子与母体分子部分连接。芳基的代表性实例包括但不限于茚满基、茚基、萘基、苯基和四氢萘基。本申请使用的术语“芳基烷基”是指取代有一个、两个或三个芳基的烷基。本申请使用的术语“氰基”是指-CN。本申请使用的术语“环烷基”是指具有三个至七个碳原子和零个杂原子的饱和单环或二环烃环系统。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基和环戊基。本申请使用的术语“(环烷基)烷基”是指取代有一个、两个或三个环烷基的烷基。本申请使用的术语“二烷基氨基”是指-NR^pR^q，其中R^p和R^q为烷基。所述烷基可相同或不同。本申请使用的术语“卤代”和“卤素”是指F、Cl、Br和I。本申请使用的术语“卤代烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的卤代烷基。本申请使用的术语“卤代烷氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的卤代烷氧基。本申请使用的术语“卤代烷基”是指取代有一个、两个、三个或四个卤素原子的烷基。本申请使用的术语“杂环基”是指含有一个、两个、三个或四个独立选自氮、氧和硫的杂原子的五、六或七元环。所述五元环具有零至两个双键且所述六和七元环具有零至三个双键。术语“杂环基”也包括二环基团和三环基团，在所述二环基团中杂环基环与以下基团稠合：苯基、单环环烯基、单环环烷基或另一个单环杂环基；在所述三环基团中二环环系与以下基团稠合：苯基、单环环烯基、单环环烷基或另一个单环杂环基。本发明杂环基可通过该基团中的碳原子或氮原子与母体分子部分连接。杂环基的实例包括但不限于苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫吗啉基。本申请使用的术语“杂环基烷基”是指取代有一个、两个或三个杂环基的烷基。本申请使用的术语“羟基”是指-OH。本申请使用的术语“-NR^aR^b”是指通过氮原子与母体分子部分连接的两个基团R^a和R^b。R^a和R^b独立选自氢、烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、杂环基和杂环基烷基。本申请使用的术语“(NR^aR^b)羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的-NR^aR^b。本申请使用的术语“(NR^aR^b)磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分连接的-NR^aR^b。本申请使用的术语“磺酰基”是指-SO₂-。本发明化合物可按可药用盐的形式存在。本申请使用的术语“可药用盐”是指本发明化合物的盐形式或两性离子形式，这些形式是水溶性或水可分散性的或是油溶性或油可分散性的，这些形式在合理的医药判断范围内适用于与患者的组织接触而不引起过度的毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症，这与合理的益处/风险比例相称且这些形式就其所预期的用途而言是有效的。所述盐可在化合物的最终分离和纯化期间制备，或可通过使合适的碱性官能团与合适的酸反应来单独制备。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、枸橼酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲基苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、吡啶-3-甲酸盐、萘-2-磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。可用于形成可药用加成盐的酸的实例包括无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸)和有机酸(例如草酸、马来酸、琥珀酸和枸橼酸)。碱加成盐可在化合物的最终分离和纯化期间如下制备：使酸性基团与合适的碱例如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐反应，或使酸性基团与氨、有机伯胺、有机仲胺或有机叔胺反应。可药用盐中的阳离子包括锂离子、钠离子、钾离子、钙离子、镁离子和铝离子及无毒的季胺阳离子例如铵根离子、四甲基铵根离子、四乙基铵根离子、甲胺铵根阳离子、二甲胺铵根阳离子、三甲胺铵根阳离子、三乙胺铵根阳离子、二乙胺铵根阳离子、乙胺铵根阳离子、三丁胺铵根阳离子、吡啶铵根阳离子、N，N-二甲基苯胺铵根阳离子、N-甲基哌啶铵根阳离子、N-甲基吗啉铵根阳离子、二环己胺铵根阳离子、普鲁卡因铵根阳离子、二苄胺铵根阳离子、N，N-二苄基苯乙胺铵根阳离子和N，N’-二苄基乙二胺铵根阳离子。可用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。本申请使用的术语“抗HCV活性”是指化合物可有效治疗HCV病毒。术语“本发明化合物”及等价表达方式意在包括式(I)化合物及其可药用对映异构体、非对映异构体和盐。类似地，在上下文允许的情况下，当提及中间体时，意在包括其盐。术语“患者”包括人类和其它哺乳动物。术语“药物组合物”是指组合物，其包含本发明化合物及至少一种其它药物载体即辅料、赋形剂或媒介物，例如稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调节剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂，这取决于给药模式和剂型的性质。例如可使用Remington’sxa0Pharmaceuticalxa0Sciences，18^thxa0ed.，Mackxa0Publishingxa0Company，Easton，PA(1999)中列出的成分。本申请使用的短语“可药用”是指在合理的医药判断范围内适用于与患者的组织接触而不引起过度的毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症的那些化合物、物质、组合物和/或剂型，这与合理的益处/风险比例相称。本申请使用的术语“磺酰基”是指-SO₂-。本申请使用的术语“亚磺酰基”是指-S(O)-。术语“治疗有效量”是指各种活性组分的总量，所述总量足以显示出有意义的患者益处(例如病毒载量的持续减少)。所述术语当用于单独给药的一种活性成分时是指该成分的单独量。所述术语当用于组合时是指各活性成分引起治疗效果的组合量而不论是组合给药、先后给药或同时给药。术语“治疗”是指：(i)在可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断患有所述疾病、障碍和/或病症的患者中预防所述疾病、障碍和/或病症；(ii)抑制所述疾病、障碍和/或病症，即阻止其发展；和/或(iii)缓解所述疾病、障碍和/或病症，即引起所述疾病、障碍和/或病症的消退。当用于命名本发明化合物时，本申请使用的符号P1’、P1、P2、P2^*、P3和P4标示了相对于天然肽裂解底物发生的结合发生结合的蛋白酶抑制剂中氨基酸残基的相对位置。裂解在天然底物中发生在P1和P1’之间，其中非初始位置表示开始于肽天然裂解位点的C-末端且向N-末端延伸的氨基酸；然而，初始位置由裂解位点标识的N-末端出发且向C-末端延伸。例如，P1’是指远离裂解位点C-末端右侧的第一位置(即N-末端第一位置)；然而，P1由裂解位点C-末端左侧开始编号，P2为由所述C-末端开始的第二位置等(参见Bergerxa0A.&xa0Schechterxa0I.，Transactionsxa0ofxa0thexa0Royalxa0Societyxa0Londonxa0series(1970)，B257，249-264)。不对称中心存在于本发明化合物中。例如，所述化合物可包含下式的P1环丙基单元：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="398"/>其中C₁和C₂各自表示在环丙基环的1-位和2-位的不对称碳原子。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>(1R，2S)xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0(1S，2R)R²处于羰基的顺式xa0xa0xa0xa0xa0xa0R²处于羰基的顺式ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>(1R，2R)xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0(1S，2S)R²处于酰胺的顺式xa0xa0xa0xa0xa0xa0R²处于酰胺的顺式应该理解的是，本发明涵盖所有立体化学形式或其混合物，它们具有抑制HCV蛋白酶的能力。本发明某些化合物还可按不同的稳定构象形式存在，这些形式是可分离的。由于围绕不对称单键的受限旋转(例如因为位阻或环张力)而导致的扭转不对称性可使不同的构象异构体得以分离。本发明包括这些化合物的每种构象异构体及其混合物。本发明某些化合物可按两性离子形式存在且本发明包括这些化合物的每种两性离子形式及其混合物。当治疗有效量的式(I)化合物及其可药用盐可按化学物质原形式来给药而用于治疗时，活性成分可按药物组合物的形式来提供。因此，本发明还提供药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐及一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。式(I)化合物及其可药用盐如上所述。载体、稀释剂或赋形剂就与制剂中的其它成分相容而言必须是可接受的且就其接受者而言必须是没有害处的。本发明另一个方面还提供制备药物制剂的方法，其包括将式(I)化合物或其可药用盐与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂混合。药物制剂可按单位剂量形式来提供，其在每个单位剂量中含有预定量的活性成分。本发明化合物的以下剂量水平即约0.01至约150毫克/千克(“mg/kg”)体重/日优选为约0.05至约100mg/kg体重/日在对由HCV介导的疾病进行预防和治疗的单一疗法中是典型的。通常，本发明药物组合物将被每日给药约1至约5次，或可选择地，可按连续输注的形式来给药。上述给药可用作慢性疗法或急性疗法。可与载体物质混合以制备单一剂型的活性成分的量将基于以下因素而变化：所治疗的病症、所述病症的严重程度、给药时间、给药途径、所用化合物的排泄速率、治疗的持续时间及患者的年龄、性别、体重和状态。优选的单位剂量制剂是这样的单位剂量制剂，其含有上述日剂量或亚剂量或其合适分数的活性成分。通常，治疗开始于基本小于化合物最佳剂量的小剂量。然后剂量以小的增幅增加直到实现对病情的最佳效果。通常，化合物以如下浓度水平来给药是最期望的，所述浓度水平通常将提供有效的抗病毒结果而不引起任何有害或有毒的副作用。当本发明组合物包含本发明化合物和一种或多种其它治疗药物和/或预防药物的组合时，所述化合物和所述其它药物都可按以下剂量存在，所述剂量小于或等于单一疗法给药方案中通常给药的剂量。本发明组合物可与一种或多种其它治疗药物或预防药物一起配制，例如呈整体片剂和/或双层/多层片剂的形式，或可与所述治疗药物或预防药物分开给药。可对药物制剂进行调整以通过任何合适的途径来给药，所述途径为例如口服(包括口腔或舌下)途径、直肠途径、经鼻途径、局部(包括口腔、舌下或透皮)途径、阴道途径或胃肠外(包括皮下注射或输注、皮内注射或输注、肌内注射或输注、关节内注射或输注、滑膜内注射或输注、胸骨内注射或输注、鞘内注射或输注、病灶内注射或输注、静脉内注射或输注或皮内注射或输注)途径。上述制剂可通过药学领域已知的任何方法来制备，所述方法为例如将活性成分与载体或赋形剂混合。适于口服给药的药物制剂可按以下形式来提供：离散的单位形式(例如胶囊剂或片剂)；粉末剂或颗粒剂；在水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；可食用的泡沫剂或搅打剂；或水包油型液态乳剂或油包水型乳剂。例如，就以片剂或胶囊剂形式进行的口服给药而言，可将活性药物组分与口服的无毒的可药用惰性载体例如乙醇、甘油、水等混合。粉末剂如下制备：将化合物研磨至合适的微细尺寸，然后与经类似研磨的药物载体例如可食用的碳水化合物(例如淀粉或甘露醇)混合。矫味剂、防腐剂、分散剂和着色剂也可存在。胶囊剂如下制备：如上所述来制备粉末混合物，然后填充到成形的明胶壳中。可将助流剂和润滑剂例如胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇加到粉末混合物中，然后进行填充操作。还可加入崩解剂或增溶剂例如琼脂、碳酸钙或碳酸钠以改善胶囊剂被摄入时的药物利用度。另外，当期望或需要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺到混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然胶和合成胶(例如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇等。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂例如如下配制：制备粉末混合物，制粒或预压，加入润滑剂和崩解剂，然后压制成片剂。粉末混合物如下制备：将经合适研磨的化合物与上述稀释剂或基质及任选的粘合剂(例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、凝胶或聚乙烯基吡咯烷酮)、溶解延迟剂(例如石蜡)、吸收促进剂(例如季胺盐)和/或吸收剂(例如膨润土、高岭土或磷酸二钙)混合。粉末混合物可与粘合剂例如糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶液、纤维素溶液或聚合物溶液一起湿法制粒，然后挤压过筛。作为可选择的制粒方法，粉末混合物可通过压片机来处理且结果是不完全成形的预压片破裂成颗粒。颗粒可通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油来润滑以防止与片剂成形模粘连。然后将经润滑的混合物压制成片剂。也可将本发明化合物与可自由流动的惰性载体混合且在不经历制粒或预压步骤的情况下直接压制成片剂。可提供透明或不透明的保护性包衣，所述包衣由以下包衣层构成：由虫胶形成的隔离包衣层、由糖或聚合物形成的包衣层和由蜡形成的光亮包衣层。可将染料加到这些包衣中以区分不同的单位剂量。口服流体例如溶液剂、糖浆剂和酏剂可按剂量单位形式来制备，从而使给定的量含有预定量的化合物。糖浆剂可通过将化合物溶于经合适矫味的水溶液中来制备，而酏剂通过使用无毒的媒介物来制备。也可加入增溶剂和乳化剂(例如乙氧基化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚)、防腐剂、矫味添加剂(例如薄荷油、天然甜味剂、糖精或其它人造甜味剂)等。当合适时，可对用于口服给药的剂量单位制剂进行微囊化。制剂也可例如如下制备以延长或维持释放：将颗粒物质用聚合物、蜡等包衣或包埋到聚合物、蜡等中。式(I)化合物及其可药用盐也可按脂质体递送系统的形式来给药，所述脂质体递送系统为例如小单层脂囊、大单层脂囊和多层脂囊。脂质体可由各种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱来形成。式(I)化合物及其可药用盐也可通过使用单克隆抗体作为与化合物分子偶联的单独载体来递送。化合物也可与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。上述聚合物可包括聚乙烯基吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基甲基丙烯酸酰胺苯酚(polyhydroxypropylmethacrylamidephenol)、聚羟基乙基天冬氨酸酰胺苯酚(polyhydroxyethylaspartamidephenol)或取代有棕榈酰基的聚氧化乙烯聚赖氨酸(polyethyleneoxidepolylysinexa0substitutedxa0withxa0palitoylxa0residue)。另外，化合物可与可用于实现药物控制释放的一类生物可降解的聚合物偶联，所述聚合物为例如聚乳酸、聚ξ-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联共聚物或水凝胶的两亲性嵌段共聚物。适于透皮给药的药物制剂可按离散的贴剂形式来提供，其意在与接受者的表皮紧密接触且保持延长的时段。例如，如Pharmaceuticalxa0Research，3(6)，318(1986)中所一般描述，活性成分可从贴剂中通过离子电渗法来递送。可将适于局部给药的药物制剂配制成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、粉末剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。就治疗眼部或其它外部组织例如口和皮肤而言，制剂优选以局部用软膏剂或局部用乳膏剂的形式来施用。当配制成软膏剂时，活性成分可与石蜡或水可混溶性软膏剂基质一起使用。可选择地，可将活性成分与水包油型乳膏剂基质或油包水型基质一起配制成乳膏剂。适于局部给药至眼部的药物制剂包括滴眼剂，其中将活性成分溶于或悬浮于合适的载体尤其是水性溶剂中。适于在口中局部给药的药物制剂包括锭剂、含锭剂和口腔洗剂。适于直肠给药的药物制剂可按栓剂或灌肠剂的形式来提供。适于鼻部给药的其中载体为固体的药物制剂包括一系列粉末，其以吸入方式来给药，即从接近鼻部的装有粉末的容器中经由鼻道而快速吸入。适于以鼻喷雾剂或滴鼻剂的形式进行给药的其中载体为液体的制剂包括活性成分的水性溶液或油溶液。适于吸入给药的药物制剂包括由微细颗粒构成的粉尘或气雾，其可通过各种类型的计量剂量的加压的气雾器、喷雾器或吸入器来产生。适于阴道给药的药物制剂可按阴道栓剂、棉塞剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂的形式来提供。适于胃肠外给药的药物制剂包括：水性和非水性无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与所预期接受者的血液等渗的溶质；及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含助悬剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量容器或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中且可在冷冻干燥的(冻干的)状态下贮存，其仅需要在使用前即时加入无菌液态载体例如注射用水。现用现配的注射溶液剂和混悬剂可由无菌粉末剂、颗粒剂或片剂来制备。应该理解的是，除上文具体提及的成分外，在考虑到所述制剂类型的情况下，所述制剂还可包含本领域中的其它常规物质，例如适于口服给药的那些制剂可包含矫味剂。下表1列出了可与本发明化合物一起给药的化合物的一些示例性实例。本发明化合物可在联合疗法中与其它具有抗HCV活性的化合物同时给药或分开给药，或通过将各种化合物混合成组合物来给药。表1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="458"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>本发明化合物也可用作实验室试剂。所述化合物可用于提供以下研究工具，所述研究工具用于设计病毒复制测定、验证动物测定系统和进行结构生物学研究以进一步提高对HCV疾病机理的认识。另外，本发明化合物可用于建立或确定其它抗病毒化合物的结合位点(例如通过竞争性抑制)。本发明化合物也可用于处理或预防物质的病毒污染，因此降低了与这些物质(例如血液、组织、手术器械和手术外衣、实验室仪器和实验室外衣及采血装置和物质或输血装置和物质)发生接触的实验室人员或医务人员或患者感染病毒的风险。当式(I)化合物通过合成性过程或通过代谢性过程(包括发生在人体或动物体内(在体内)的那些代谢性过程或发生在体外的过程)来制备时，本发明包括这样的式(I)化合物。本发明现将通过某些实施方案来描述，所述实施方案不是意在限制本发明范围。相反地，本发明涵盖可包括在权利要求书范围内的所有可选形式、变化形式和等价形式。因此，以下实施例(包括具体的实施方案)将说明本发明具体实施方式，其中应该理解的是，所述实施例意在说明某些实施方案且意在提供这样的内容，所述内容就本发明构思和实施而言据信是最有用且最容易理解的。本申请使用的缩写(尤其包括以下示例性方案和实施例中使用的缩写)是本领域技术人员公知的。所使用的一些缩写如下：DCM表示二氯甲烷；min表示分钟；h表示小时；EtOAc表示乙酸乙酯；HATU表示O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；DMSO表示二甲基亚砜；THF表示四氢呋喃；MeOH表示甲醇；BOC₂O表示一缩二碳酸二叔丁酯；DMAP表示4-(N，N-二甲基氨基)吡啶；TLC表示薄层色谱；sat.表示饱和的；r.t/rt/RT表示室温或保留时间(根据上下文)；DAST表示二乙基氨基三氟化硫；CDI表示1，1’-羰基二咪唑；且DBU表示1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。可用于合成本发明化合物的原料是本领域技术人员已知的且可容易制备或可商购得到。出于示例性目的而提供以下方法而非意在限制权利要求书的范围。应该理解的是，制备以下化合物可能是必须的，所述化合物中的官能团使用常规保护基来保护，然后除去所述保护基，从而提供本发明化合物。根据本发明来使用保护基的细节是本领域技术人员已知的。实施例1：化合物1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="552"/>方案1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>方案1步骤1在-78℃向二甲基亚砜(28.0ml，395mmol)于DCM(150ml)中的溶液中滴加草酰氯(99ml，198mmol)。将形成的溶液在该温度搅拌30分钟。在-78℃滴加(2S，4R)-4-羟基吡咯烷-1，2-二羧酸1-苄基酯·2-甲基酯(25.08g，90mmol)于DCM(150ml)中的溶液。将形成的白色浆液在-78℃搅拌2小时，然后滴加N，N-二异丙基乙胺(78ml，449mmol)。将最终粉色溶液在室温搅拌3小时。用冰冷却的1Mxa0HCl、5％枸橼酸和盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且浓缩。残余的浅棕色油状物通过柱色谱(先后用4∶1、3∶1和2∶1己烷/EtOAc洗脱)来纯化，得到所需产物(17.8g，72％收率)，其为浅棕色粘性油状物。¹Hxa0NMR(CDCl₃)δ2.58-2.63(m，1H)，2.90-2.99(m，1H)，3.62，3.77(s，3H，旋转异构体)，3.95-4.02(m，2H)，4.82-4.89(m，1H)，5.11-5.24(m，2H)，7.32-7.39(m，5H)。方案1步骤2在0℃向(S)-4-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-苄基酯·2-甲基酯(13.24g，47.8mmol)于甲苯(400mL)中的溶液中滴加联苯-4-基溴化镁(124mL，62.1mmol)。将形成的浅黄色溶液在该温度搅拌1小时。用NH₄Cl淬灭，分离有机层。水层用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且浓缩。残余物通过用硅胶塞过滤(先后用4∶1、3∶1、2∶1和3∶2己烷/EtOAc洗脱)来纯化，得到10.50g白色固体，所述固体用EtOAc/己烷(50ml/150ml)重结晶，得到7.50g所需产物，其为小的粉色针状物。浓缩母液且通过Biotage柱(用5％～50％EtOAc/己烷洗脱)来纯化，又得到1.89g所需产物。¹HNMR(CDCl₃)δ2.39-2.45(m，1H)，2.70-2.75(m，1H)，3.66，3.86(s，3H，旋转异构体)，3.80-3.90(m，1H)，4.00-4.07(m，1H)，4.62(dd，J_1，2＝9.5，28Hz，1H)，5.09-5.15(m，1H)，5.21-5.25(m，1H)，7.31-7.38(m，6H)，7.42-7.45(m，2H)，7.54-7.59(m，6H)。LC-MS(保留时间：2.77分钟，方法A)，MSxa0m/zxa0414(M⁺-H₂O)，370(M⁺-H₂O-CO₂)。方案1步骤3在室温向(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-4-羟基吡咯烷-1，2-二羧酸1-苄基酯·2-甲基酯(3236mg，7.5mmol)和丙-2-烯-1-硫醇(834mg，9.00mmol)于乙腈(40mL)中的透明溶液中一次性加入三(三氟甲磺酸)钪(III)固体(369mg，0.750mmol)。将形成的粉色溶液在该温度搅拌20小时。用饱和氯化铵淬灭，用EtOAc萃取。有机物用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且真空浓缩。残余物通过Biotage柱(用5％～50％EtOAc/己烷洗脱)来纯化，得到非对映异构体的混合物(2.88g，79％)和原料(0.600g，18％)。该非对映异构体的混合物通过Biotage柱(用2％～8％EtOAc/甲苯洗脱)来再次纯化，得到所需产物(2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)吡咯烷-1，2-二羧酸1-苄基酯·2-甲基酯(900mg，1.661mmol，22.15％收率)，其为由所述柱收集的第二个峰且为粘性油状物。¹HNMR(500MHz，氯仿-D)δppmxa02.59-2.76(m，1H)2.78-2.93(m，3H)3.60(s，1.5H)3.77(s，1.5H)3.92(d，J＝11.60Hz，1H)4.17-4.31(m，1H)4.34-4.49(m，1H)4.92-5.07(m，2H)5.08-5.34(m，2H)5.53-5.72(m，1H)7.23-7.41(m，6H)7.45(t，J＝7.63Hz，3H)7.48-7.67(m，5H)。LC-MS(保留时间：3.32分钟，方法A)，MSxa0m/z488(M+H)。方案1步骤4向冰冷却的(2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)吡咯烷-1，2-二羧酸1-苄基酯·2-甲基酯(1.85g，3.79mmol)于乙腈(20mL)中的溶液中加入三甲基碘甲硅烷(0.810mL，5.69mmol)。将形成的浅棕色溶液在室温搅拌2小时。用冰浴冷却，用甲醇(7.68mL，190mmol)淬灭。形成的浅棕色溶液通过制备性HPLC来纯化且收集的馏分通过旋转蒸发系统来蒸发。将黄色残余物吸收在DCM中，用饱和Na₂CO₃和盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且真空浓缩，得到所需产物(2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(664mg，1.878mmol，49.5％收率)，其为粘性油状物。¹Hxa0NMR(500MHz，MeOD)δppm2.96-3.09(m，3H)3.15(d，J＝14.34Hz，1H)3.84(d，J＝12.21Hz，1H)3.96(s，2.5H)4.00(s，0.5H)4.04(d，J＝11.90Hz，1H)4.77(dd，J＝10.07，3.05Hz，1H)5.02(d，J＝9.77Hz，1H)5.09(d，J＝17.09Hz，1H)5.54-5.68(m，1H)7.38(t，J＝7.48Hz，1H)7.44-7.54(m，4H)7.66(d，J＝7.32Hz，2H)7.71(d，J＝8.55Hz，2H)。LC-MS(保留时间：2.21分钟，方法A)，MSxa0m/zxa0354(M+H)。方案1步骤5向(2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(355mg，1.004mmol)、(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3，3-二甲基丁酸(256mg，1.105mmol)和HATU(573mg，1.506mmol)于DCM(10mL)中的浆液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.526mL，3.01mmol)。将形成的溶液在室温搅拌过夜。用1Mxa0HCl、1Mxa0NaOH和盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且浓缩。残余物通过Biotage柱(用5％～50％丙酮/己烷梯度洗脱)来纯化，得到所需产物(2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3，3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(416mg，0.661mmol，65.8％收率)，其为白色泡沫。¹Hxa0NMR(400MHz，MeOD)δppmxa01.10(s，9H)1.46(s，9H)2.54(dd，J＝12.80，7.78Hz，1H)2.86-3.02(m，3H)3.72(s，3H)3.98-4.11(m，1H)4.30(t，J＝7.65Hz，1H)4.37-4.48(m，1H)4.74-4.87(m，1H)4.94-5.12(m，2H)5.63-5.79(m，1H)7.35(t，J＝7.28Hz，1H)7.44(t，J＝7.53Hz，2H)7.57-7.71(m，6H)。LC-MS(保留时间：3.09分钟，方法B)，MSxa0m/z567(M+H)。方案1步骤6向(2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3，3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(362mg，0.639mmol)于THF(5mL)和MeOH(5.00mL)中的溶液中加入预制备的氢氧化锂水合物(80mg，1.916mmol)于水(5mL)中的溶液。将所得混浊溶液在室温搅拌24小时。用5％枸橼酸淬灭，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且浓缩，得到所需产物(2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3，3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-羧酸(312mg，0.553mmol，87％收率)，其为白色固体。LC-MS(保留时间：2.96分钟，方法B)，MSxa0m/zxa0553(M+H)。方案2ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>方案2步骤1将(1R，2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-乙烯基环丙烷羧酸苄酯(4.82g，15.19mmol)、BOC₂O(7.05mL，30.4mmol)和DMAP(0.371g，3.04mmol)的溶液在45℃加热且通过TLC来监测。冷却反应混合物且用EtOAc稀释。其用饱和NaHCO₃溶液洗涤，然后先后用饱和NH₄Cl溶液和盐水洗涤。干燥有机物，过滤且浓缩，得到粗物质。其通过Biotage(5-20％EtOAc/己烷)来纯化，得到产物，其为无色油状物(5.8g，91％)。¹Hxa0NMR(500MHz，氯仿-d)δppmxa01.24(t，J＝7.17Hz，3H)，1.32-1.44(m，1H)，1.45-1.67(m，18H)，1.89(dd，J＝8.70，5.95Hz，1H)，2.26(q，J＝8.95Hz，1H)，4.05-4.35(m，2H)，5.15(dd，J＝10.22，1.37Hz，1H)，5.23-5.48(m，1H)，5.87(ddd，J＝17.24，9.61，9.46Hz，1H)。方案2步骤2在0℃将四氧化锇(1.891mL，0.309mmol)加到(1R，2S)-1-(二(叔丁氧基羰基)氨基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(11g，30.9mmol)于叔丁醇(500mL)和四氢呋喃(50.0mL)中的溶液中。向其中加入高碘酸钠(16.55g，77mmol)于水(50mL)中的溶液。反应混合物变为白色沉淀物的稠厚浆液。15分钟后，移开冰浴且将反应混合物温热至室温过夜。反应混合物用硅藻土过滤。滤饼用EtOAc洗涤。真空浓缩滤液。将残余物吸收在EtOAc中且用盐水洗涤。干燥有机物，过滤且蒸发，得到粗物质。粗物质通过Biotage(15-20％EtOAc/己烷)来纯化，得到产物，其为无色油状物(9g，81％)。¹Hxa0NMR(300MHz，氯仿-d)δppmxa01.27(t，J＝7.14Hz，3H)1.50(s，18H)1.78(dd，J＝9.51，6.22Hz，1H)2.30(td，J＝9.06，5.67Hz，1H)2.48(dd，J＝8.42，6.22Hz，1H)4.16-4.33(m，2H)9.47(d，J＝5.86Hz，1H)。LC-MS：412(MW+32+22+1)。方案2步骤3在0℃将DAST(3.14mL，23.78mmol)加到(1R，2R)-1-(二(叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲酰基环丙烷羧酸乙酯(1.7g，4.76mmol)于二氯甲烷(50mL)中的溶液中且在0℃搅拌3小时。反应通过滴加冷的饱和NaHCO₃溶液来淬灭。有机物用饱和氯化钠洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤且浓缩，得到粗物质。粗物质通过Biotage快速色谱(10％EtOAc/己烷)来纯化，得到纯产物，其为无色油状物(600mg，33.2％)。¹Hxa0NMR(300MHz，氯仿-d)δppmxa01.14-1.29(m，1H)1.21(t，J＝7.14Hz，3H)1.33-1.52(m，18H)1.81-1.94(m，1H)1.98-2.18(m，1H)4.16(q，J＝6.95Hz，2H)5.65-6.13(m，J＝55.62，55.62，7.32，7.32，7.32Hz，1H)。方案2步骤4向(1R，2R)-1-(二(叔丁氧基羰基)氨基)-2-(二氟甲基)环丙烷羧酸乙酯(540mg，1.423mmol)于四氢呋喃(7mL)和MeOH(7.00mL)中的混合物中加入2Mxa0LiOH的水溶液(3.56mL，7.12mmol)且在室温搅拌过周末。然后其用乙醚萃取，水层用1Nxa0HCl酸化直到pH＝3。然后其用乙酸乙酯萃取，用MgSO₄干燥，过滤且浓缩，得到340mg(95％)灰白色固体。¹HNMR(500MHz，MeOD)δppm1.39-1.54(m，10H，)1.64-1.87(m，1H)，1.88-2.11(m，1H，)5.91(t，J＝55.85Hz，1H)。方案3ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>方案3步骤1向冰冷却的环丙烷磺酰胺(1.21g，9.99mmol)、三乙胺(2.95mL，20.97mmol)和4-二甲基氨基吡啶(0.061g，0.499mmol)于CH₂Cl₂(50mL)中的浆液中滴加一缩二碳酸二叔丁酯(2.423mL，10.99mmol)于DCM(10mL)中的溶液。将形成的溶液在室温搅拌过夜。真空除去溶剂。将残余的油状物吸收在EtOAc中且用1Mxa0HCl和盐水洗涤。用MgSO₄干燥，过滤且浓缩。残余物通过Biotage柱(用5％～50％丙酮/己烷梯度洗脱)来纯化，得到所需产物环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁酯(2.17g，9.61mmol，96％收率)，其为粘性油状物，所述油状物当在实验台上静置时固化。¹Hxa0NMR(400MHz，CDCl₃)δppmxa01.11-1.13(m，2H)1.37-1.399m，2H)1.53(s，9H)，2.89-2.92(m，1H)7.00-7.05(b，NH)。方案3步骤2在-78℃向环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁酯(885mg，4mmol)于THF(20mL)中的溶液中滴加正丁基锂(3.36mL，8.40mmol)(2.5M于己烷中)。将形成的溶液温热至室温且搅拌1.5小时。将该浅黄色溶液冷却回至-78℃。滴加7-溴-1-庚烯(1.219mL，8.00mmol)。历时16小时将最终溶液温热至室温。用饱和NH₄Cl淬灭，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且浓缩。残余物通过Biotage柱(用5％～40％EtOAc/己烷梯度洗脱)来纯化，得到所需产物1-(庚-6-烯基)环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁酯(625mg，1.772mmol，44.3％收率)，其为粘性油状物，所述油状物当在实验台上静置时固化。¹HNMR(400MHz，氯仿-D)δppmxa00.88-1.02(m，2H)1.26-1.49(m，6H)1.53(s，9H)1.60-1.71(m，2H)1.82-1.94(m，2H)2.06(q，J＝6.94Hz，2H)4.81-5.08(m，2H)5.68-5.88(m，1H)6.88(b，NH)。LC-MS(保留时间：2.76分钟，方法A)，MSm/zxa0218(M+H-Boc)。方案3步骤3将4.0Mxa0HCl于二噁烷中的溶液(4.285mL，17.14mmol)加到1-(庚-6-烯基)环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁酯(544mg，1.714mmol)中且在室温搅拌3小时。倒入水中，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且真空浓缩。残余物通过Biotage柱(用5％～60％EtOAc/己烷梯度洗脱)来纯化，得到所需产物1-(庚-6-烯基)环丙烷-1-磺酰胺(350mg，1.578mmol，92％收率)，其为白色固体。¹Hxa0NMR(400MHz，氯仿-D)δppmxa00.82-0.94(m，2H)1.28-1.53(m，8H)1.84-1.97(m，2H)2.06(q，J＝6.94Hz，2H)4.49(b，NH2)4.89-5.07(m，2H)5.70-5.90(m，1H)。方案3步骤4向(1R，2R)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(二氟甲基)环丙烷羧酸(100mg，0.398mmol)于四氢呋喃(4mL)中的溶液中加入CDI(84mg，0.517mmol)且将形成的溶液在室温搅拌3小时。加入1-(庚-6-烯基)环丙烷-1-磺酰胺(104mg，0.478mmol)和DBU(0.120mL，0.796mmol)且使反应在室温继续过夜。反应混合物用EtOAc稀释。用5％枸橼酸和盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且浓缩。残余物通过Biotage柱(用5％～70％EtOAc/己烷梯度洗脱)来纯化，得到所需产物(1R，2R)-2-(二氟甲基)-1-(1-(庚-6-烯基)环丙基磺酰基氨甲酰基)环丙基氨基甲酸叔丁酯(45mg，0.100mmol，25.09％收率)。¹Hxa0NMR(400MHz，氯仿-D)δppmxa00.95(s，2H)1.28-1.36(m，2H)1.36-1.47(m，6H)1.52(s，9H)1.58-1.67(m，2H)1.72(d，J＝10.54Hz，1H)1.78-1.95(m，2H)1.97-2.12(m，3H)4.88-5.05(m，2H)5.23(b，NH)5.65-5.92(m，2H)9.20(b，NH)。方案3步骤5将4.0Mxa0HCl于二噁烷中的溶液(500μL，2mmol)加到(1R，2R)-2-(二氟甲基)-1-(1-(庚-6-烯基)环丙基磺酰基氨甲酰基)环丙基氨基甲酸叔丁酯(45mg，0.100mmol)中且在室温搅拌过夜。真空除去溶剂。形成的产物按原样用于以下偶联反应。¹Hxa0NMR(400MHz，MeOD)ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="34"/>ppmxa00.89-1.07(m，2H)1.26-1.65(m，8H)1.72(t，J＝2.76Hz，1H)1.82-1.95(m，2H)2.06(q，J＝7.03Hz，2H)2.17-2.32(m，2H)4.89-4.95(m，1H)4.95-5.06(m，1H)5.69-6.19(m，2H)。方案3步骤6向(2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3，3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-羧酸(55.3mg，0.10mmol)、(1R，2R)-1-氨基-2-(二氟甲基)-N-(1-(庚-6-烯基)环丙基磺酰基)环丙烷甲酰胺(38.7mg，0.10mmol)和HATU(57.0mg，0.150mmol)于DCM(2mL)中的浆液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.087mL，0.500mmol)。将形成的溶液在室温搅拌过夜。用DCM稀释，用1Mxa0HCl和盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤且浓缩。残余物通过Biotage柱(用5％～30％丙酮/己烷梯度洗脱)来纯化，得到所需产物(S)-1-((2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-2-((1R，2R)-2-(二氟甲基)-1-(1-(庚-6-烯基)环丙基磺酰基氨甲酰基)环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(65mg，0.073mmol，73％收率)，其为白色泡沫。¹HNMR(400MHz，MeOD)δppmxa00.81-0.88(m，2H)1.07(s，9H)1.21-1.61(m，17H)1.64-1.80(m，1H)1.81-2.12(m，6H)2.37(t，J＝11.42Hz，1H)2.91-3.05(m，3H)3.91(dd，J＝10.29，6.53Hz，1H)3.98(d，J＝11.04Hz，1H)4.48(d，J＝9.79Hz，1H)4.86-5.13(m，5H)5.66-6.14(m，3H)7.36(t，J＝7.28Hz，1H)7.45(t，J＝7.53Hz，2H)7.52-7.76(m，6H)。LC-MS(保留时间：3.39分钟，方法B)，MSxa0m/z885(M+H)。方案3步骤7(S)-1-((2S，4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-2-((1R，2R)-2-(二氟甲基)-1-(1-(庚-6-烯基)环丙基磺酰基氨甲酰基)环丙基氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(73mg，0.082mmol)于二氯甲烷(20mL)中的溶液用氮气吹洗5分钟。然后加入第二代Hoveyda-Grubbs催化剂(62.2mg，0.099mmol)。将所得绿色溶液回流加热5小时。真空除去溶剂。绿色残余物通过Biotage柱(用5％～40％丙酮/己烷梯度洗脱)来纯化，得到所需产物，其为灰白色固体(12mg，0.013mmol，15.45％收率)。¹Hxa0NMR(400MHz，MeOD)δppmxa00.92-1.10(m，11H)1.34-1.62(m，18H)1.64-1.83(m，2H)1.93-2.11(m，4H)2.75(dd，J＝13.05，10.54Hz，1H)2.87(dd，J＝15.31，7.03Hz，1H)3.10-3.25(m，2H)4.02(d，J＝10.79Hz，1H)4.17(dd，J＝10.04，6.53Hz，1H)4.26-4.38(m，1H)4.73(d，J＝10.54Hz，1H)5.53-5.69(m，2H)5.69-6.06(m，1H)6.41(d，J＝9.29Hz，NH)7.35(t，J＝7.28Hz，1H)7.44(t，J＝7.53Hz，2H)7.53-7.75(m，6H)。LC-MS(保留时间：3.27分钟，方法B)，MSxa0m/zxa0801(M+H-t-Bu)。实施例2：化合物2ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="552"/>在方案3步骤7的反应中还分离到顺式异构体，其为白色固体(3mg，3.15μmol，3.82％收率)。¹Hxa0NMR(400MHz，MeOD)δppmxa00.88-0.99(m，2H)0.98-1.13(m，9H)1.38(s，9H)1.42-1.67(m，11H)1.68-1.83(m，2H)1.90-2.04(m，1H)2.12-2.30(m，1H)2.79(dd，J＝13.18，8.91Hz，1H)2.96-3.07(m，1H)3.13-3.25(m，1H)4.15(d，J＝11.04Hz，1H)4.26(t，J＝7.91Hz，1H)4.33(t，J＝10.29Hz，1H)4.65(d，J＝10.79Hz，1H)5.30-5.43(m，1H)5.46-5.57(m，1H)5.70-6.10(m，1H)6.45(d，J＝9.54Hz，NH)7.34(t，J＝7.28Hz，1H)7.43(t，J＝7.53Hz，2H)7.53-7.80(m，6H)。LC-MS(保留时间：3.27分钟，方法B)，MSxa0m/zxa0801(M+H-t-Bu)。用于方法A的LC/MS条件：起始％B＝0；最终％B＝100；梯度时间＝3分钟；停止时间＝4分钟；流速＝4ml/min；波长＝220nm；溶剂A＝90％水-10％甲醇-0.1％TFA；溶剂B＝10％水-90％甲醇-0.1％TFA；柱3＝(3)PHENOMENEX-LUNA4.6×50mmxa0S10。用于方法B的LC/MS条件：起始％B＝30；最终％B＝100；梯度时间＝3分钟；停止时间＝4分钟；流速＝4ml/min；波长＝220nm；溶剂A＝90％水-10％甲醇-0.1％TFA；溶剂B＝10％水-90％甲醇-0.1％TFA；柱3＝(3)PHENOMENEX-LUNA4.6×50mmxa0S10。生物学研究HCVxa0NS3/4A蛋白酶复合酶测定和基于细胞的HCV复制子测定用于本发明且如下制备、进行和验证：重组HCVxa0NS3/4A蛋白酶复合物的制备源自BMS株、H77株或J4L6S株的HCVxa0NS3蛋白酶复合物如下制备。制备这些经纯化的重组蛋白以在均质测定(见下)中使用，从而显示本发明化合物如何有效地抑制HCVxa0NS3蛋白水解活性。来自HCV感染患者的血清得自Dr.T.Wright，Sanxa0Franciscoxa0Hospital。HCV基因组(BMS株)的工程化全长cDNA(互补脱氧核糖核酸)模板由以下DNA片段来构建，所述DNA片段如下得到：对血清RNA(核糖核酸)进行反转录PCR(RT-PCR)且使用基于其它基因型1a株之间的同源性而选择的引物。通过确定完整的基因组序列且根据Simmonds等人的分类方法(参见PSimmonds，KAxa0Rose，Sxa0Graham，SWxa0Chan，Fxa0McOmish，BCxa0Dow，EAxa0Follett，PLxa0Yapxa0andxa0Hxa0Marsden，J.Clin.Microbiol.，31(6)，1493-1503(1993))将基因型1a归属为HCV隔离群。非结构区域即NS2-5B中的氨基酸序列被证实与HCV基因型1a(H77)具有＞97％的相同性且与基因型1b(J4L6S)具有＞87％的相同性。感染性克隆H77(基因型1a)和感染性克隆J4L6S(基因型1b)得自R.Purcell(NIH)且序列公开在Genbank中(AAB67036，参见Yanagi，M.，Purcell，R.H.，Emerson，S.U.andxa0Bukh，J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16)，8738-8743(1997)；AF054247，参见Yanagi，M.，Stxa0Claire，M.，Shapiro，M.，Emerson，S.U.，Purcell，R.H.andxa0Bukh，J.，Virologyxa0244(1)，161-172.(1998))。H77株和J4L6S株用于制备重组NS3/4A蛋白酶复合物。这些株中编码重组HCVxa0NS3/4A蛋白酶复合物(氨基酸1027至1711)的DNA如P.Gallinari等人所述那样来处理(参见GallinariP，Paolinixa0C，Brennanxa0D，Nardixa0C，Steinkuhlerxa0C，Dexa0FrancescoR.Biochemistry.38(17)：5620-32，(1999))。简言之，在NS4A编码区域的3’-端加入三赖氨酸增溶尾部。将位于NS4A-NS4B裂解位点中P1-位的半胱氨酸(氨基酸1711)变为甘氨酸以避免赖氨酸标签的蛋白水解性裂解。另外，通过PCR在氨基酸1454-位将半胱氨酸变异为丝氨酸以防止NS3解螺旋酶结构域的自溶性裂解。按照经修改的P.Gallinari等人所述的方案(参见Gallinarixa0P，Brennanxa0D，Nardixa0C，Brunettixa0M，Tomeixa0L，Steinkuhlerxa0C，Dexa0Francescoxa0R.，Jxa0Virol.72(8)：6758-69(1998))，将变体DNA片段克隆到pET21b细菌表达载体(Novagen)中且在大肠杆菌株BL21(DE3)(Invitrogen)中表达NS3/4A复合物。简言之，NS3/4A蛋白酶复合物的表达用0.5毫摩尔浓度(mM)的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在20℃诱导22小时(h)。常规发酵(1升(L))，得到约10克(g)湿的细胞团块。将细胞重新混悬在细胞溶解缓冲液中(10mL/g)[所述细胞溶解缓冲液含有25mMxa0N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)(pHxa07.5)、20％甘油、500mM氯化钠(NaCl)、0.5％TritonX-100、1微克/毫升(“μg/mL”)溶菌酶、5mM氯化镁(MgCl₂)、1μg/mlxa0DNA酶I、5mMxa0β-巯基乙醇(βME)、蛋白酶抑制剂-乙二胺四乙酸(EDTA)(游离的)(Roche)]，匀化且在4℃培养20分钟(min)。对匀浆进行超声波处理且通过在4℃以235000G超速离心1小时(h)而变得澄清。将咪唑加到上清液中至最终浓度为15mM且将pH调节至8.0。将粗蛋白提取物加载到用缓冲液B(25mMHEPES(pHxa08.0)、20％甘油、500mMxa0NaCl、0.5％Tritonxa0X-100、15mM咪唑、5mMβME)预平衡的镍-氨基三乙酸(Ni-NTA)柱上。样品以1mL/min的流速来加载。柱用15倍柱体积的缓冲液C(与缓冲液B相同但含有0.2％Tritonxa0X-100)洗涤。蛋白质用5倍柱体积的缓冲液D(与缓冲液C相同但含有200mM咪唑)洗脱。合并含有NS3/4A蛋白酶复合物的馏分且加载到用缓冲液D(25mMHEPES(pHxa07.5)、20％甘油、300mMxa0NaCl、0.2％Tritonxa0X-100、10mMxa0βME)预平衡的脱盐柱Superdex-S200上。样品以1mL/min的流速来加载。合并含有NS3/4A蛋白酶复合物的馏分且浓缩至约0.5mg/ml。源自BMS、H77和J4L6S株的NS3/4A蛋白酶复合物的纯度通过SDS-PAGE和质谱分析而确定为大于90％。将酶贮存在-80℃，在冰上解冻，稀释，然后在测定缓冲液中使用。FRET肽测定以监测HCVxa0NS3/4A蛋白水解活性该体外测定的目的是测量本发明化合物对上述源自BMS株、H77株或J4L6S株的HCVxa0NS3蛋白酶复合物的抑制。该测定显示了本发明化合物如何有效地抑制HCVxa0NS3蛋白水解活性。为了监测HCVxa0NS3/4A蛋白酶活性，使用NS3/4A肽底物。底物为RETS1(共振能量转移缩酚酸肽底物；AnaSpec，Inc.，目录号22991)(FRET肽)(参见Talianixa0etxa0al.，Anal.Biochem.240(2)：60-67(1996))。该肽的序列大致基于HCVNS3蛋白酶所针对的NS4A/NS4B天然裂解位点，不同的是在裂解位点存在酯连接基而非酰胺键。所述肽还在其一端附近含有荧光供体EDANS及在另一端附近含有荧光受体DABCYL。肽的荧光通过供体和受体之间的分子间共振能量转移(RET)来淬灭，但当NS3蛋白酶使肽裂解时，产物不再发生RET淬灭且供体的荧光变得明显。在不存在或存在本发明化合物的情况下，将肽底物与三种重组NS3/4A蛋白酶复合物之一一起培养。化合物的抑制作用如下确定：使用Cytofluor4000系列来实时监测荧光反应产物的形成。试剂如下：HEPES和甘油(超纯的)得自GIBCO-BRL。二甲基亚砜(DMSO)得自Sigma。β-巯基乙醇得自Bioxa0Rad。测定缓冲液：50mMxa0HEPES(pHxa07.5)；0.15Mxa0NaCl；0.1％Triton；15％甘油；10mMβME。底物：2μM最终浓度(由2mM在DMSO中的储备液(贮存在-20℃)稀释)。HCVxa0NS3/4A蛋白酶1a(1b)型：2-3nM最终浓度(由5μM在25mMxa0HEPES(pHxa07.5)、20％甘油、300mMxa0NaCl、0.2％Triton-Xxa0100、10mMxa0βME中的储备液稀释)。对于效能接近测定极限的化合物，如下使测定变得较灵敏：将50μg/ml牛血清白蛋白(Sigma)加到测定缓冲液中且将蛋白酶最终浓度降至300pM。测定在96孔聚苯乙烯黑色板(Falcon)中进行。每个孔含有NS3/4A蛋白酶复合物在测定缓冲液中的25μl溶液、本发明化合物在10％DMSO/测定缓冲液中的50μl溶液和底物在测定缓冲液中的25μl溶液。对照溶液(无化合物)也在同一块测定板中制备。将酶复合物与化合物或对照溶液混合1分钟，然后通过加入底物来引发酶反应。测定板立即使用Cytofluorxa04000系列(Perspectivexa0Biosystems)来读取。将仪器设定为在25℃读取340nm的发射波长和490nm的激发波长。反应通常进行约15分钟。抑制百分数用以下方程式计算：100-[(δF_抑制剂/δF_对照)×100]其中δF为曲线线性范围内的荧光变化。将非线性曲线拟合应用于抑制-浓度数据且50％有效浓度(IC₅₀)通过Excelxa0XLfit软件使用方程式y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))来计算。以多于一种类型的NS3/4A复合物对本发明化合物进行测试且发现所测试的本发明化合物具有类似的抑制性质，尽管与1a株相比，所述化合物都显示出对1b株的较大效能。特异性测定进行特异性测定以证实与其它丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶相比，本发明化合物就抑制HCVxa0NS3/4A蛋白酶复合物而言具有体外选择性。本发明化合物的特异性用多种丝氨酸蛋白酶(人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、猪胰弹性蛋白酶(PPE)和人胰糜蛋白酶)和一种半胱氨酸蛋白酶(人肝组织蛋白酶B)确定。在所有情况下，如先前所述(PCT专利申请WOxa000/09543)使用96孔板方案(就丝氨酸蛋白酶测定而言进行一些修改)，所述方案使用对每种酶具有特异性的荧光性氨基-甲基-香豆素(AMC)底物。所有酶购自Sigma和EMDbiosciences，而底物来自Bachem、Sigma和EMDbiosciences。化合物的浓度为100至0.4μM，这取决于它们的效能。酶测定各自如下引发：将底物加到在室温预培养10分钟的酶-抑制剂中且水解至转化率为15％(用Cytofluor测量)。每项测定的最终条件如下：50mM三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pHxa08)、0.5M硫酸钠(Na₂SO₄)、50mMxa0NaCl、0.1mMxa0EDTA、3％DMSO、0.01％吐温-20、5μMLLVY-AMC和1nM糜蛋白酶。50mMxa0Tris-HCl(pHxa08.0)、50mMxa0NaCl、0.1mMxa0EDTA、3％DMSO、0.02％吐温-20、5μM琥珀酸-AAPV-AMC和20nMxa0HNE或8nMxa0PPE。100mMxa0NaOAc(乙酸钠)(pHxa05.5)、3％DMSO、1mMxa0TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)、5nM组织蛋白酶B(使用前将酶储备液在含有20mMxa0TCEP的缓冲液中活化)和在H₂O中稀释的2μMxa0Z-FR-AMC。抑制百分数使用下式来计算：[1-((UV_抑制剂-UV_空白)/(UV_对照-UV_空白))]×100将非线性曲线拟合应用于抑制-浓度数据且50％有效浓度(IC₅₀)通过使用Excelxa0XLfit软件来计算。HCV复制子的制备HCV复制子全细胞系统如Lohmannxa0V，Kornerxa0F，Kochxa0J，Herianxa0U，Theilmannxa0L，Bartenschlagerxa0R.，Sciencexa0285(5424)：110-3(1999)中所述来建立。该系统能够评价本发明HCV蛋白酶化合物对HCVxa0RNA复制的作用。简言之，使用Lohmann论文中描述的HCVxa01b株序列(登录号为AJ238799)，HCVcDNA由Operonxa0Technologies，Inc.(Alameda，CA)来合成，然后使用标准分子生物学技术将全长复制子组装到质粒pGem9zf(+)(Promega，Madison，WI)中。所述复制子包含(i)与壳体蛋白中的前12个氨基酸融合的HCVxa05’UTR、(ii)新霉素磷酸转移酶基因(neo)、(iii)来自脑炎心肌炎病毒(EMCV)的IRES及(iv)HCVxa0NS3至NS5B基因和HCVxa03’UTR。通过插入以下cDNA对复制子构建体进行修饰，所述cDNA编码人化形式的Renilla荧光素酶基因和与所述荧光素酶基因的3’-端直接稠合的连接子序列。使用位于核中的Asc1限制性位点将该插入物引入到复制子构建体中，所述位点恰在新霉素标志物基因的上游。还在1179-位引入了适应性突变(丝氨酸变为异亮氨酸；然后编号为S2204I)(Blightxa0KJ，Kolykhalov，AA，Rice，CM，Sciencexa02000290(5498)：1972-1974)。质粒DNA用ScaI线性化且RNA转录物使用T7Megascript转录试剂盒(Ambion，Austin，TX)根据制造商提供的说明书来在体外合成。将cDNA的体外转录物转染到人肝瘤细胞系HUH-7中。在选择性标志物新霉素(G418)存在下将组成性表达HCV复制子的细胞选择出来。所得细胞系用正链和负链RNA随时间的产生和蛋白质随时间的产生来表征。如以上就1b复制子细胞系所述，稳定的HCV基因型1a复制子细胞系用类似的基因组图谱制备。还在1496-位引入了额外的适应性代替(脯氨酸变为亮氨酸)(Lemmxa0JA，Liuxa0M，Rosexa0RE，Fridellxa0R，O’Boylexa0Iixa0DR，colonnoxa0R，Gaoxa0M.Intervirology.200548(2-3)：183-91)。H77感染性克隆的序列(详见上文)用于制备亚复制子，所述亚复制子也含有选择性标志物G418和Renilla荧光素酶基因。HCV复制子荧光素酶报告子测定开发出HCV复制子荧光素酶测定以监测本发明化合物对HCV病毒复制的抑制作用。复制子荧光素酶报告子测定的使用首先由Krieger等人描述(Kriegerxa0N，Lohmannxa0V，andxa0Bartenschlagerxa0R，J.Virol.75(10)：4614-4624(2001))。使组成性表达HCV复制子的HUH-7细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco-BRL)(含有10％胎牛血清(FCS)(Sigma)和1mg/mlxa0G418(Gibco-BRL))中生长。以3倍将化合物连续稀释在DMSO中用于二十点滴定，然后转移到用组织培养基处理的无菌384孔板(Corning，目录号3571)中。然后以3.0×10³个细胞/孔的密度将细胞(50μLxa0DMEM(含有4％FCS))接种到这些板中(DMSO的最终浓度为0.5％)。在37℃培养3天后，细胞的Renilla荧光素酶活性使用EnduRen作为底物(Promega，目录号E6485)来分析。将EnduRen底物在DMEM中稀释，然后加到板中至最终浓度为7.5μM。将板在37℃培养2小时，然后立即在Viewluxxa0Imager(PerkinElmer)上使用发光程序来读取30秒。为了评价化合物的细胞毒性，CC₅₀值如下得到：用Cellxa0Titer-Blue(Promega，目录号G8082)对含有EnduRen的板进行倍增。将Cell-Titerxa0Blue(3μL)加到每个孔中且在37℃培养8小时。在Viewluxxa0Imager上读取来自每个孔的荧光信号，其中激发波长为525/10nm且发射波长为598/10nm。抑制百分数使用下式来计算：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>对值进行作图且使用XLfit来分析以得到EC₅₀值。对本发明化合物进行测试且发现其具有以下活性：xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0IC₅₀(nM)xa0xa01a/1bxa0EC₅₀(nM)化合物1xa0xa0xa0xa02xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa049/21化合物2xa0xa0xa0xa04xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa095/33本领域技术人员应该理解的是，本发明不限于上述示例性实施例且在不背离本发明基本属性的情况下本发明可按其它具体形式来实施。因此，应该理解的是，所述实施例在各个方面都应该被视为示例性而非限制性，应该参考所附权利要求书而非上述实施例且落入权利要求书的等价意义和范围内的所有变化形式都应该包括在本发明范围内。